КОНЪЮГАТ БИОТИН-ТИРОКСИН КАК БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ЛИГАНД СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

© 2009 г. М. Е. Новаковский^#, И. И. Вашкевич, О. В. Свиридов

^#Тел.: +375 172 637 275; e-mail: maxushob@tut.by

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141, Минск, ул. Купревича, 5/2

Поступила в редакцию 16.04.2008 г. Принята к печати 25.09.2008 г.

Получен конъюгат, содержащий остатки витамина Н (биотин; Bt) и гормона щитовидной железы тироксина (Т₄) путем N-ацилирования N-(3-аминопропил)биотинамида N-оксисукцинимидным эфиром N-ацетилтироксина. Методами электронной спектроскопии, иммуноферментного анализа и компьютерного моделирования изучены взаимодействия конъюгата Bt-Т₄ с одним или одновременно с двумя связывающими белками, проявляющими сродство к Bt или Т₄, в растворе и на твердой фазе. Bt-Т₄ специфически фиксировался в Bt-связывающем сайте молекулы стрептавидина за счет большого числа водородных связей и гидрофобных взаимодействий. В результате комплексообразования сдвигался в длинноволновую область максимум и снижалась интенсивность собственной флуоресценции стрептавидина, причем степень тушения эмиссии белка была существенно выше, чем в случае комплекса стрептавидин–Bt. Дополнительное тушение флуоресценции вызывалось чувствительными к рН, ионной силе и детергентам взаимодействиями, стабилизирующими положение тироксиновой части конъюгата вблизи остатка Trp120 стрептавидина в его комплексе с Bt-Т₄. Конъюгат Bt-Т₄ образовывал также специфический эквимольный комплекс с Т₄-связывающим глобулином человека (ТСГ) по механизму, что и Т₄, причем остаток Bt не участвовал во взаимодействиях, изменяющих характеристики флуорофоров ТСГ. В твердофазной системе ИФА конъюгат Bt-Т₄ за счет своей биотиновой функции связывался с авидином на твердой фазе, а экспонированная в раствор тироксиновая часть взаимодействовала с поликлональными антителами к Т₄, причем интактный Т₄, добавленный в систему, конкурентно ингибировал это взаимодействие. В другой иммуноаналитической системе бифункциональная активность Bt-Т₄ проявлялась в связывании конъюгата со стрептавидином, меченным хелатом Eu³⁺, и последующем образовании трехкомпонентного комплекса с участием моноклонального антитела к Т₄, иммобилизованного на твердой фазе. Свободный Т₄ пропорционально своей концентрации в пробе сыворотки крови человека ингибировал тироксиновую функцию конъюгата, связанного с меченым стрептавидином. Параметры иммунофлуоресцентного анализа указывали на то, что комплекс стрептавидина с Bt-Т₄, активно связываясь с антителом к Т₄, практически не взаимодействует с сывороточными Т₄-связывающими белками, в том числе с ТСГ. По-видимому, неспецифические взаимодействия остатка Т₄ со стрептавидином в его комплексе Bt-Т₄ наряду со стерическими факторами затрудняют проникновение тироксинила в составе этого комплекса в активные центры ТСГ и других Т₄-связывающих белков сыворотки крови. Синтезированный по простой схеме стабильный конъюгат Bt-Т₄ может использоваться как бифункциональный лиганд связывающих белков в биохимических исследованиях и иммуноаналитических системах для медицинской диагностики.

Ключевые слова: конъюгат биотин-тироксин; стрептавидин; бифункциональный лиганд; тушение флуоресценции; лантанидный иммунофлуориметрический анализ.

Биоорг.химия 2009, 35 (2): 178-191