ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ. II. ИЗОТЕРМИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА ПРИ АНАЛИЗЕ ДНК МЕТОДОМ МИНИ-СЕКВЕНИРОВАНИЯ

© 2010 г. Е. В. Дмитриенко*^,2*, Е. А. Хомякова²*, И. А. Пышная*, А. Г. Брагин³*^,4*, В. Е. Ведерников³*^,4*, Д. В. Пышный*^,#

^#Тел./факс: (383) 335-62-23; e-mail: pyshnyi@niboch.nsc.ru

*Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 8;
²*Новосибирский государственный университет;
³*Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск;
⁴*ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово промзона, 36, Новосибирская обл.

Поступила в редакцию 12.02.2010 г. Принята к печати 16.02.2010 г.

Исследовано явление амплификации гибридизационного сигнала в реакциях ограниченного удлинения олигонуклеотидных зондов в составе комплементарных комплексов с анализируемой ДНК (мини-секвенирование) в изотермических условиях. Показано повышение интенсивности регистрируемого сигнала в ходе реализации данной схемы за счет многократного ферментативного мечения олигонуклеотидных зондов в составе субстратных дуплексов с одной молекулой ДНК-матрицы как в гомо-, так и в гетерофазном формате анализа, при использовании различных способов детекции (радиоизотопное, флуоресцентное мечение или ферментопосредованное выявление). Предложена схема процесса и определены основные кинетические параметры каждой стадии. Установлена взаимосвязь между интенсивностью сигнала и физико-химическими характеристиками комплексов зонд/ДНК и продукт/ДНК. Максимальная интенсивность сигнала достигается при минимальной разнице в термодинамической стабильности комплексов зонд/ДНК и продукт/ДНК, при этом температура реакции должна быть близка к температуре плавления дуплексов; отклонения как в большую, так и в меньшую сторону ведут к уменьшению количества сигнального продукта. Показано, что интенсивность сигнала гибридизационного анализа в системе с многократным мечением олигонуклеотидных зондов на матрице анализируемой ДНК существенно снижается при наличии в исследуемой последовательности однонуклеотидных несоответствий. Анализ ДНК в режиме мини-секвенирования позволяет проводить не только выявление, но и количественную характеризацию анализируемой ДНК.

Ключевые слова: гибридизационный анализ ДНК, изотермическая амплификация сигнала, мини-секвенирование, олигонуклеотидные зонды.

Биоорг.химия 2010, 36 (6): 802-814