ВЫЯВЛЕНИЕ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА С ПОМОЩЬЮ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ РЕПОРТЕРОВ

^#Тел. 8 (391) 249-44-30; e-mail: lfrank@yandex.ru

*Институт биофизики СО РАН, 660036, Красноярск, Академгородок, стр.50;
**Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск

Поступила в редакцию: 02.06.2011 г. Принята к печати: 30.08.2011 г.

Предложен метод определения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) на основе реакции удлинения праймера (PEXT) с последующим биолюминесцентным твердофазным микроанализом продуктов. В качестве репортеров использовали Са²⁺-регулируемый фотопротеин обелин и целентеразин-зависимую люциферазу Renilla muelleri. Исследования проводили на примере генотипирования SNP гена, кодирующего коагуляционный фактор V человека – FV Leiden (Лейденская мутация) 1691 G→A (R506Q). Геномную ДНК амплифицировали полимеразной цепной реакцией, используя праймеры, фланкирующие полиморфный сайт. Продукты ПЦР размером 140 п.о. использовали как матрицу для двух PEXT-реакций с праймерами, 3'-концевые нуклеотиды которых комплементарны нормальному либо мутантному аллелям. При полной комплементарности матрицы и аллель-специфичного праймера происходило его удлинение ДНК-полимеразой, а полученный продукт содержал биотин, благодаря наличию в реакционной смеси биотинилированного производного дезоксиуридинтрифосфата (B-dUTP). Анализ продуктов проводили с использованием химических коньюгатов обелин-стрептавидин. Определены оптимальные условия проведения PEXT-реакции, позволяющие проводить генотипирование SNP с высокой достоверностью. Разработан вариант одновременного выявления обоих аллелей в одной лунке с использованием двух биолюминесцентных репортеров. Эффективность предлагаемого подхода показана при исследовании клинических образцов ДНК.

Ключевые слова: SNP; PEXT-реакция; обелин; люцифераза; биолюминесцентный микроанализ.