ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДМОНОФОСФАТКИНАЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т5 МЕТОДОМ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА

Г. В. Микулинская*^,#, С. А. Таран*, Ю. С. Скоблов**, С. А. Феофанов*

^#Тел.: +7 (4967) 73-17-80; e-mail: mikulinskaya@bibch.ru

*Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Пущино, проспект Науки, 6;
**ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Поступила в редакцию 23.04.2013 г. Принята к печати 23.05.2013 г.

На основании компьютерной модели активного центра дезоксирибонуклеозидмонофосфат-киназы бактериофага Т5 (dNMPKT5) определены аминокислотные остатки, важные для ферментативной активности. В результате сайт-направленного мутагенеза, клонирования и экспрессии гена dNMPKT5 в клетках E.coli получен ряд белков, содержащих единичные замены консервативных аминокислотных остатков активного центра – S13A, D16N, T17N, T17S, R130K, K131E, Q134A, G137A, T138A, W150F, W150A, D170N, R172I, E176Q. После ионообменной и аффинной хроматографической очистки полученные препараты мутантных форм белка были электрофоретически гомогенными. Исследование ферментативной активности этих белков на природных акцепторах фосфорильной группы (dAMP, dCMP, dGMP, dTMP) показало, что замены заряженных аминокислот NMP-связывающего домена – R130, R172, D170 и E176 – приводят к практически полной потере ферментативных свойств. Установлено, что для каталитической активности фермента важно наличие НО-группы аминокислотного остатка в положении 17. На основании изменений удельной активности мутантных форм фермента предполагается, что остатки аргининов 130 и 172 участвуют в связывании γ-фосфорильной группы донора и α-фосфорильной группы акцептора, а остаток аспарагиновой кислоты в положении 16 АТР-связывающего сайта также участвует в связывании ряда акцепторов фосфорила, прежде всего dTMP. Непропорциональное изменение ферментативной активности на разных субстратах у частично активных мутантов – G137A, T138A, T17N, Q134A, S13A, D16N – позволяет предполагать, что в связывании разных акцепторов фосфорила участвуют разные аминокислотные остатки.

Ключевые слова: нуклеозидмонофосфаткиназа, бактериофаг Т5, сайт-направленный мутагенез.

Биоорг. химия 2013, 39 (6): 680-692