ПОДХОД “РАЗДЕЛЯЙ И ВЛАСТВУЙ” ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ МУЛЬТИДОМЕННЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОТЕНЦИАЛ-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ КАНАЛОВ Kv2.1 И Nav1.4 ЧЕЛОВЕКА¹

^#Тел.: +7(495)336-59-29, эл. почта: zakhar-shenkarev@yandex.ru

*ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10;
**Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9;
***Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова, 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12

Поступила в редакцию 21.06.2017 г. Принята к печати 04.07.2017 г.

DOI: 10.7868/S0132342317060033

Потенциал-зависимые K⁺- и Na⁺-ионные каналы вовлечены в широкий спектр физиологических процессов, включая возбудимость сердечных, мышечных и нервных клеток, а также секрецию гормонов и нейромедиаторов. Эти каналы имеют модульную структуру и состоят из пяти мембранных доменов: четырех потенциал-чувствительных доменов (ПЧД) и одного порового домена. На ПЧД различных каналов локализованы уникальные сайты связывания с лигандами, поэтому ПЧД рассматриваются в качестве перспективных фармакологических мишеней. Модульная организация ионных каналов позволяет ставить задачи по структурным ЯМР-исследованиям изолированных ПЧД отдельно от поры. В настоящей работе рассмотрена возможность таких исследований на примере ПЧД канала Kv2.1 человека и первого ПЧД канала Nav1.4 человека. Разработаны сопряженные системы бесклеточного синтеза на основе бактериального экстракта S30 из E. coli, позволяющие получать миллиграммовые количества препаратов ПЧД, включая меченые стабильными изотопами аналоги. Важным этапом ЯМР-исследований является подбор мембраномоделирующей среды, обеспечивающей долговременную стабильность природной структуры мембранного белка в растворе и высокое качество ЯМР-спектров. Скрининг различных сред показал, что домены каналов Kv2.1 и Nav1.4 нестабильны в средах, содержащих фосфолипиды: мицеллах короткоцепочечного липида DC7PC и липид-детергентных бицеллах на основе цвиттер-ионных или анионных насыщенных липидов (DMPC и DMPG). Показано, что оптимальной средой для структурных ЯМР-исследований являются смеси цвиттерионного и слабокатионного детергентов (FOS-12/LDAO). Однако, несмотря на высокое качество спектров, образец ПЧД канала Nav1.4 в окружении FOS-12/LDAO необратимо агрегировал в течение нескольких дней. Вероятно, ПЧД K⁺- и Na⁺-каналов человека не являются полностью автономными мембранными доменами и для их стабилизации необходимы контакты с другими доменами канала.

Ключевые слова: сопряженная бесклеточная система синтеза, мембраномоделирующие среды, мембранные белки, ионные каналы, потенциал-чувствительный домен, ЯМР-спектроскопия.

Биоорг. химия 2017, 43 (6): 608-619

__________________

¹Статья публикуется по материалам сообщения, представленного на VIII Российском симпозиуме “Белки и пептиды”, 18–22 сентября 2017 г., г. Москва