ЭФФЕКТИВНОСТЬ АМПЛИФИКАЦИИ И СУБСТРАТНЫЕ СВОЙСТВА ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННЫХ ТРИФОСФАТОВ ДЕЗОКСИУРИДИНА В ПЦР С ДНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ, НЕ ОБЛАДАЮЩИМИ 3'-5'-ЭКЗОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

^#Тел.: +7 (495) 135-98-00; факс: +7 (495) 135-14-05; эл. почта: lapa@biochip.ru

*ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН”, Россия, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32

Поступила в редакцию 19.11.2018 г. После доработки 10.12.2018 г. Принята к публикации 29.01.2019 г.

DOI: 10.1134/S0132342319040043

Исследована кинетика амплификации продукта в ПЦР при использовании в качестве субстрата флуоресцентно-меченных цвиттер-ионных трифосфатов дезоксиуридина с различной структурой флуорофора и различной длиной линкера, связывающего флуорофор с азотистым основанием; изучена зависимость выхода ПЦР-продукта от концентрации модифицированного субстрата в реакционной смеси; проведен гибридизационный анализ полученных продуктов амплификации. Для амплификации использованы ДНК-полимеразы Taq и Vent (exo-), не обладающие 3'-5'-экзонуклеазной активностью. Выявлено, что гидрофобность и пространственные размеры флуорофора являются важными факторами, влияющими на ингибирование ДНК-полимераз в ПЦР, в то время как длина линкера между флуорофором и азотистым основанием оказывает существенное влияние на субстратные свойства, т.е. эффективность встраивания меченых нуклеотидов дезоксиуридина в растущую цепь ДНК. Наиболее эффективными для применения в ПЦР с последующим флуоресцентным гибридизационным анализом на биочипах оказались электронейтральные производные трифосфата дезоксиуридина со средней длиной линкера. Исследованные соединения пригодны для введения метки в ПЦР-продукты с помощью Taq- и Vent (exo-)-ДНК-полимераз для гибридизационного анализа ДНК.

Ключевые слова: кинетика ПЦР, индодикарбоцианиновые красители, флуоресцентно-меченные нуклеозидтрифосфаты, гибридизация, биочип

Биоорг. химия 2019, 45 (4): 392-402